Cianofilia

Clitocybe nebularis

Con tale termine s’intende la capacità che hanno alcuni elementi fungini (parete sporale, ornamentazioni, parete delle ife) di assumere una tonalità azzurra se posti a contatto con alcuni coloranti quali il Blu cotone o Blu di metile.
Tali coloranti si possono fissare più o meno decisamente su queste strutture e, in base a tale peculiarità, è possibile distinguere le spore in:
• cianofile (quando la membrana si colora da blu a violetto; come ad esempio, nel Genere Entoloma);
• acianofile (quando la membrana non assume tale colorazione; come, ad esempio, nel Genere Tricholoma.
In buona sostanza si parla di reazione cianofila quando una parete (sporale o ifale) si colora assorbendo il Blu cotone mentre l’interno della spora o ifa rimane incolore. Anche alcune ornamentazioni, quali: verruche, aculei, creste possono essere cianofile, come ad esempio in numerose specie del Genere Ramaria, in Aleuria e Scutellina.
La formulazione del colorante varia a seconda che si operi su materiale fresco o d’erbario.

Blu cotone: andrà impiegato, in soluzione acquosa allo 0,1% su campioni freschi.
Per la sua preparazione si opera nel modo seguente:
sciogliere 50 mg di Blu cotone in polvere in 50 mL di acqua distillata. La soluzione è così pronta.

Blu lattico: si usa come la soluzione acquosa di Blu cotone. Può essere impiegato anche per il materiale d’erbario in quanto l’acido lattico è un rigonfiante.
Per la sua preparazione basta sciogliere 50 mg di Blu cotone in 30 mL di acido lattico, agitando energicamente. Lasciare riposare per 24 ore agitando ogni tanto. Filtrare.

Blu cotone in lattofenolo per exsiccatum.
Si usa una soluzione di Blu cotone al 5% in lattofenolo.
E’ sufficiente sciogliere 2,5 g di Blu cotone in polvere in 47,5 g di lattofenolo. Rispetto al Blu lattico ha un effetto più moderato e perciò migliore.

Blu tripano
A.- Soluzione secondo Clemençon, modificata secondo Erbe Matheis. 1. Acqua distillata: 80 mL;
2. KOH: 0,8 g;
3. NaCl: 0,8 g;
4. Invadin: 0,5 g;
5. Fenolo (C6H5OH) in cristalli: 0,5 g;
6. Blu tripano in polvere: 0,5 g;
7. Glicerina F.U. [CH2(OH)CH(OH)CH2(OH)]: 20 g.

B.- Soluzione secondo Dade
1. Soluzione acquosa di Blu tripano allo 0,2%: 50 mL; 2. Acido lattico F.U.[CH3CH(OH)COOH]: 100 g;
3. Fenolo: 100 g;
4. Glicerina F.U.: 150 mL;
5. Acqua distillata: 50 mL.

Modalità di preparazione:
A.- Mescolare nell’ordine indicato i reagenti da 1 a 5, quindi aggiungere il colorante e mescolare con nottolino su piastra magnetica per almeno 2 ore. Solo a questo punto versare la glicerina. Mescolare, attendere 24 ore ed infine filtrare.

B.- Preparare una soluzione acquosa del colorante sciogliendone 500 mg in 250 mL di acqua distillata.
Prelevarne 50 mL e miscelare con gli altri reattivi citati.
Il suo uso è particolarmente prezioso per colorare lo strato interno delle pareti ifali e di alcune spore.

Esecuzione del saggio:
Fare delle sottile fettine della parte che si vuole esaminare, collocarle su di un vetrino, mettere vicino una goccia di Blu lattico e farvi scivolare dentro le fettine.
Bisogna comunque considerare che anche se diluito il reagente risulta denso per cui richiede un lungo assorbimento, vi sono tre possibilità:

  • 1. si attende un tempo variabile da 3 a 48 ore, in dipendenza della consistenza del fungo, poi si asciuga il residuo di Blu lattico, si aggiunge Cloralio idrato o L4, si copre con il coprioggetto e si osserva.
  • 2. Si copre con il coprioggetto, si prende il vetrino con le pinzette per non rischiare di ustionarsi, si colloca sopra una fonte di calore e si attende l’ebollizione. A questo punto si procede al rapido raffreddamento del preparato per evitare che bruci troppo lasciandolo cadere con delicatezza su di una superficie liscia e fredda (marmo, tavolo, pavimento). A questo punto si può osservare direttamente, o meglio si colloca una goccia di Cloralio idrato o L4 appoggiata ad un lato del coprioggetto mentre dal lato opposto si appoggia della carta assorbente. Se necessario aggiungere ancora Cloralio idrato. La carta assorbente attirerà verso di sé il Blu lattico mentre il Cloralio idrato ne prenderà il posto.
  • 3. Si riscaldano le fettine immerse nel Blu lattico direttamente sul vetrino ma senza coprioggetto, tenendo sempre il vetrino con una pinzetta, come spiegato al punto 2., ponendolo su una fonte di calore fino all’ebollizione. Aggiungere una goccia di Blu lattico fresco ed asciugare. Aggiungere ora il Cloralio idrato o L4, coprire con il copri oggetto e passare all’osservazione.

E’ già stato detto che se le spore o le ife appaiono incolori sono acianofile, come pure se a colorarsi è il plasma ma non la parete, questo può trarre in inganno, bisogna quindi procedere all’osservazione a 100X con immersione in olio e sfochettare lentamente per capire quale parte della cellula sia interessata dalla reazione. Per avere un termine di paragone conviene sempre avere la possibilità di una contro-reazione, esaminando sia una specie dichiaratamente cianofila che una acianofila.
Molto evidente l’acianofilia nelle spore di Amanita, che costituiscono quindi un ottimo esempio e termine di paragone.
In spore fortemente pigmentate (Agaricus, Psathyrella, ecc.), per evidenti motivi, non è possibile verificare tale reazione.
Singer nei suoi studi afferma che quegli Agaricales delle Famiglie di Agaricaceae, Cortinariaceae, Rhodophyllaceae, Paxillaceae, Gomphidiaceae, Boletaceae, in cui il colore delle spore mature non inibisce l’osservazione dell’assorbimento del Blu cotone, hanno generalmente spore da leggermente a fortemente cianofile, mentre il gruppo di Agaricales con spore più o meno pallide (Amanitaceae, Hygrophoraceae, Polyporaceae s.s.) presentano spore acianofile.
Nelle Tricholomataceae e Russulaceae lo strato esterno amiloide delle spore e la parete di spore pseudoamiloidi sono generalemente acianofile, mentre altre Tricholomataceae hanno parete sporale o ornamentazioni più o meno cianofile: Crinipellis, Chaetocalathus, Lepista, Macrocystidia, Oudemansiella, Armillariella, Fayodia, Laccaria.
Hanno spore cianofile la maggior parte delle Clitocybe con polvere sporale rosa, come pure Pluteus e Volvariella, Cystolepiota, parte delle Tephrocybe, Boletus, Lepiota, Entoloma, Hygrophoropsis, Lyophyllum, Calocybe, Asterophora.

Riferimenti bibliografici:

  • 1. Alessandro Francolini “Enciclopedia Micologica” A.M.I.N.T..
  • 2. M. T. Basso “Manuale di Microscopia dei Funghi”, Libreria Mykoflora – Alassio, p. 72-76.
  • 3. S. Ruini, M. Mariotto, G. Marasca, G. Visentin, G. Michilin “Schede Tecniche di Microscopia
  • Micologica”, Centro Studi Micologici – Associazione Micologica Bresadola.

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